밤마다 모든 것이 살아나는 뉴욕 자연사 박물관의 야간 야간 경비원 래리(벤 스틸러)는 테디 루즈벨트 대통령(로빈 윌리엄스), 카우보이 제레다야(오웬 윌슨), 말썽꾸러기 원숭이 덱스터 등의 전시물들과 함께 박물관의 천문관 재개장식날 환상적인 공연을 준비한다. 그런데 자연사 박물관의 전시물들에게 밤마다 생명을 불어넣어주던 황금석판이 서서히 부식되기 시작한다. 마법의 기운을 잃어 가는 황금석판 때문에 이상해져가는 전시물들은 돌발 행동을 하면서 행사장을 아수라장으로 만든다. 래리는 박물관 친구들이 이상한 행동을 보이는 원인을 찾기 위해 황금석판의 비밀을 알고 있는 아크멘라의 부모 메렌카레(벤 킹슬리)와 세프세헤렛이 있는 런던 대영 박물관으로 향한다. 래리에게 주어진 시간은 단 하룻밤. 래리가 황금석판을 되살리지 못한다면 최후의 상황을 피할 수 없게 되는데…